Những thuốc nhuộm huỳnh quang như Fluorescein, Rhodamin có thể kết hợp với kháng thể mà không phá hủy tính chất đặc hiệu của kháng thể. Kháng thể liên hợp ấy có khả năng kết hợp với kháng nguyên và phức hợp KN-KT có thể quan sát ở kính hiển vi huỳnh quang.

Kháng thể được liên hợp với thuốc nhuộm huỳnh quang rồi cho tác dụng với kháng nguyên. Ví dụ trong chẩn đoán vi khuẩn tả sau 6 – 8 giờ nuôi cấy ở nước pepton kiềm, làm một phiến phết rồi nhuộm với kháng huyết thanh liên hợp với Fluorescein. Quan sát ở kính hiển vi huỳnh quang, ta phát hiện thấy khuẩn tả phát huỳnh quang xanh lục nếu mầu phân dương tính.

Kháng thể được cho tác dụng trực tiếp với kháng nguyên rồi cho kết hợp với kháng globulin người liên hợp với Fluorescein. Trước hết cho kháng nguyên cố định lên tiêu bản rồi cho tác dụng với huyết thanh bệnh nhân, rửa để loại bỏ kháng thể thừa sau đó nhỏ một giọt globulin người gắn Fluorescein rồi quan sát ở kính hiển vi huỳnh quang. Phương pháp này được sử dụng để chẩn đoán bệnh giang mai (phản ứng FTA – Abs), bệnh tự miễn… Phương pháp gián tiếp có nhiều ưu điểm như: Sự phát huỳnh quang mạnh hơn, tiết kiệm được thời gian nếu nhiều huyết thanh được thử nghiệm cùng một lúc.

II. PHẢN ỨNG MIỄN DỊCH ENZYME (Enzyme-linked immunosorbent assay: ELISA)

Nguyên lý: Kỹ thuật này sử dụng kháng thể hoặc kháng nguyên cố định vào một tấm polystyren. Sau đó nó được dùng để bắt kháng nguyên hoặc kháng thể đối ứng ở dung dịch thử nghiệm và phức hợp được phát hiện nhờ enzyme gắn với kháng thể hoặc kháng nguyên tác động lên cơ chất đặc hiệu. Cơ chất của enzyme thủy phân đo ở quang phổ kế, tỷ lệ với nồng độ của kháng thể hoặc kháng nguyên không biết ở trong dung dịch thử nghiệm.

Kháng nguyên hoặc kháng thể liên hợp với enzyme vẫn giữ hoạt tính miễn dịch. Enzyme được sử dụng có thể là photphatase kiễm hoặc peroxydase. Thử nghiệm cho kết quả khách quan và rất nhạy. Thử nghiệm miễn dịch liên kết enzyme được áp dựng để chẩn đoán những vi khuẩn như giang mai, Brucella, Salmonella , vi khuẩn tả..và các virus như virus viêm gan, virus sởi, virus rota…

III. PHẢN ỨNG MIỄN DỊCH PHÓNG XẠ (Radioimmunoassay: RIA)

Nguyên lý: Dùng đồng vị phóng xạ như Thymidin H 3, Cacbon 14, I 125 … đánh dấu kháng nguyên hoặc kháng thể để theo dõi phản ứng kết hợp kháng nguyên kháng thể. Có thể xác định vị trí của kháng nguyên (hoặc kháng thể) đã đánh dấu đồng vị phóng xạ bằng cách cho nhũ tương ảnh lên trên tiêu bản tổ chức học, sau đó phát hiện bằng các phương pháp chụp ảnh thông thường. Để phát hiện và đo lường đồng vị phóng xạ trong môi trường lỏng, ví dụ các đồng vị phát xạ beta (như thymidin H3, Cacbon C14), cần dùng một dung dịch nhấp nháy và đo trong máy đếm tự động. Phương pháp đồng vị phóng xạ không những có thể khu trú vị trí kết hợp một cách chính xác mà còn làm tăng độ nhạy cảm phản ứng lên hàng nghìn lần.

IV. KỸ THUẬT SẮC KÝ MIỄN DỊCH

Phức hợp kháng kháng thể (KKT) gắn chất màu được phân bố đều trên bản giấy sắc ký. Kháng nguyên (KN) đặc thù của vi sinh vật được gắn cố định tại “vạch phản ứng”. Khi nhỏ huyết thanh cần xác định kháng thể (KT) lên bản sắc ký, KT đặc hiệu (nếu có) trong huyết thanh sẽ kết hợp với KKT gắn màu, phức hợp miễn dịch KT-KKT gắn màu này di chuyển trên giấy sắc ký sẽ bị giữ lại tại “vạch phản ứng” do KT kết hợp với KN vi sinh vật, kết quả “vạch phản ứng” hiện màu. Nếu trong huyết thanh không có KT đặc hiệu, ở “vạch phản ứng” KN không thể giữ được KKT gắn màu, vì vậy không hiện màu.

Trong nhận định kết quả của các phản ứng giữa kháng nguyên và kháng thể trước hết phải lưu ý đến độ nhạy

Kết quả định tính cho biết trong mẫu xét nghiệm có hay không có kháng thể hoặc kháng nguyên. Thông thường kết quả các phản ứng được ký hiệu bằng các mức độ dương tính (+, + +, + + +) , không rõ dương tính hay âm tính (+/-), âm tính (-). Các ký hiệu này tuy có tiêu chuẩn quy định nhưng phụ thuộc vào chủ quan của người đọc kết quả.

Chẩn đoán gián tiếp các bệnh nhiễm trùng qua việc xác định kháng thể trong huyết thanh được gọi là chẩn đoán huyết thanh học. Kết quả định lượng trong chẩn đoán huyết thanh cho biết hiệu giá kháng thể. Nồng độ kháng thể trong huyết thanh cao hay thấp được đánh giá qua hiệu giá kháng thể. Thông thường kháng thể người bệnh được pha loãng dần theo cấp sô 2 hoặc 4. Đậm độ huyết thanh thấp nhất cho kết quả dương tính thì đậm độ đó là hiệu giá.

Các phản ứng định lượng cần thiết để theo dõi động lực kháng thể của các huyết thanh kép thường lấy cách nhau 7 ngày. Động lực kháng thể là đại lượng đặc trưng cho mức độ thay đổi hiệu giá kháng thể theo thời gian. Trong nhận định, quan trọng là số thương chứ không phải hiệu số giữa hai lần kết quả. Đối với bệnh virus hiệu giá kháng thể tăng lên 4 lần mới có giá trị chắc chắn.

Là ranh giới giữa hiệu giá kháng thể bình thường và hiệu giá bệnh lý. Liên cầu thường cư trú ở hầu hết mọi người nên trong huyết thanh của hầu hết mọi người đều có kháng thể kháng streptolysin O (ASO). Vì thế người ta xem 1/200 (200 đơn vị /ml), là hiệu giá ranh giới. Chỉ khi nào trong huyết thanh có 400 đơn vị/ml trở lên mới là bệnh lý.

Hay gặp lúc làm phản ứng huyết thanh học vì kỹ thuật và trong một vài trạng thái sinh lý bệnh lý của người bệnh.

Trong huyết thanh học cổ điển chẩn đoán giang mai với các kháng nguyên lipoit có thể thấy nhiều kết quả dương tính giả (sốt rét, một số bệnh ký sinh trùng khác…). Trong thực tế người ta thực hiện nhiều phản ứng huyết thanh học khác nhau cùng một lúc để kiểm tra dương tính giả. Ví dụ Kolmer, Kaln, VDRL và nhất là dùng các kháng nguyên đặc hiệu để tránh dương tính giả, ví dụ TPI, FTA-Abs…

Có nhiều nguyên nhân dẫn đến hiện tượng âm tính giả như: các thành phần tham gia phản ứng không được chuẩn độ, lượng kháng thể quá nhiều so với kháng nguyên và ngược lại, kháng thể mẫu hoặc kháng nguyên mẫu bị hỏng… Để khắc phục hiện tượng dương tính giả, âm tính giả phải chuẩn độ các thành phần tham gia phản ứng, đảm bảo đúng các điều kiện của phản ứng (dung dịch đệm, nhiệt độ,

thời gian ủ…) và phải luôn luôn có chứng dương, chứng âm.